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黄曲霉毒素 B1酶标板检测(AFB1 )ELISA 检测试剂盒使用说明书

作者:  转载自:  发布日期:2019/11/19

黄曲霉毒素 B1 酶标板检测AFB1 ELISA 检测试剂盒使用说明书

检测原理

本试剂盒采用竞争 ELISA,在微孔板上预包被黄曲霉毒素B1 抗原,加入样本/黄曲霉毒素 B1 标准品溶液及辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素 B1 抗体。样本或标准品溶液中的黄曲霉

B1 与预包被在微孔板上的黄曲霉毒素 B1 抗原竞争结合辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素 B1 抗体。未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入 TMB 显色液,读取吸光值。样本的吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素 B1 抗原的含量成负相关。对照标准曲线,即可得出相应残留物黄曲霉毒素 B1 的含量。

二、检测范围

本试剂盒是应用 ELISA 技术研发的药物残留检测产品,与仪器分析技术比较,能经济、快速地检测出玉米、大米、麦类、豆类、花生、饲料、食用油等样本中的黄曲霉毒素 B1

三、试剂盒组成

酶标板 1 块,96 /

标准液 6 瓶(1 mL/瓶):0 ppb,0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb8.1 ppb

酶标记物 ………………………………………6mL

底物液 A ………………………………………7mL

底物液 B………………………………………7mL

……………………..…………………7mL

10×浓缩洗涤液………………………………40mL

7×浓缩样品稀释液………………………………20mL

. . 1

四、使用单位需自备的设备及试剂

1)仪器

微孔板酶标仪(450 nm/630 nm)

氮气吹干装置

振荡器

离心

涡旋仪

粉碎机

电子天平(感量 0.01 g

2)器材

单道微量移液器20 μL200 μL100 μL~1000 μL

多道微量移液器30 μL300 μL

3)试剂

甲醇、石油醚、正己烷、三氯甲烷、去离子水

五、溶液的配制

样本前处理需配制:

配液 1:样品稀释液:将浓缩样品稀释液用去离子水按 1:6 体积比进行稀释(1 份浓缩样品稀释液+6 份去离子水)。

配液 2:洗涤工作液:将浓缩洗涤液用去离子水按 1:9 体积比进行稀释(1 份浓缩洗涤液+9 份去离子水)。

配液 3:啤酒稀释液:取无水甲醇,用配制完成的样品稀释液按 1:4 体积比进行稀释(1 份甲醇+4 份样品稀释液)。

配液 4 50%甲醇:取无水甲醇,用去离子水按 1:1 体积比进行稀释(1 份无水甲醇+1 份去离子水)。

六、样本前处理方法

样本处理前须知:处理任何样本时,都须注意:

1实验中必须使用一次性吸头,在吸取不同的试剂时要更换吸头。

2实验之前须检查各种实验器具是否干净,必须使用洁净实验器具,以避免污染干扰实验结果。

样本前处理步骤:

A)谷物(大米、小米等低脂含量)

1. 1 g 粉碎样品,加入 4 mL50%甲醇-水混合均匀;

2. 充分振荡混匀 5-10 min

3. 5000 r/min 离心 10min,或用定量分析滤纸过滤;

4. 400μL 离心后的上清液或过滤后的滤液加入到 600μL样品稀释液中进行稀释并充分混匀;

5. 50 μL 稀释后的样品待测。

稀释倍数:10

B)蛋糕

稀释倍数:10

B)蛋糕

1. 1g 粉碎的样品,加入 4 mL50%甲醇-水混合均匀;

2. 充分振荡混匀 5-10 min

3. 5000 r/min 离心 10min 或静置分层后去除上层液体;

4. 400 μL下层液体加入到600μL 样品稀释液中进行稀释,再加入 1ml 正己烷充分混匀;

5. 弃上层清液,取下层 50 μL 稀释后样品待测。

稀释倍数:10

C)花生、奶油蛋糕

稀释倍数:10

C)花生、奶油蛋糕

1. 1g 样品,加入 4mL 石油醚混合均匀,再加入 4ml 50%甲醇混合均匀;

2. 充分振荡混匀 5-10 min

3. 5000 r/min 离心 10 min

4. 400μL下层液体加入到600μL样品稀释液中进行稀释并充分混匀;

5. 50 μL 稀释后样品待测。

稀释倍数:10

D)食用油

1. 1.0g 样品与 4.0mL 石油醚混合均匀;

2. 加入 4mL 50%甲醇混合,振荡 1min

3. 静置 10min

4. 400μL 下层液体,加入 600μL 样品稀释液进行稀释,充

分混匀;

5. 50μL 稀释后液体待测。

稀释倍数:10

E)饲料、面粉、汤圆

稀释倍数:10

E)饲料、面粉、汤圆

1. 1g 粉碎的样品与 10mL 甲醇混合均匀;

2. 强力振荡 3min

3. 5000r 离心 10min

4. 取上层清液 200μL,加入 800μL 样品稀释液,混合均匀;

5. 50μL 稀释后液体待测。

稀释倍数:50

F)啤酒

稀释倍数:50

F)啤酒

1. 200μL 啤酒样品(预先水浴 60℃去除 CO 2 ),加入 800μL

啤酒稀释液;

2. 振荡 3min

3. 50μL 稀释后液体待测。

稀释倍数:5

G)酱油、醋、葡萄酒

稀释倍数:5

G)酱油、醋、葡萄酒

1. 0.5mL 样品,加入 0.5mL 蒸馏水并加入 4.0mL 三氯甲烷;

2. 上下颠倒 20 次以上混匀,5000r/min 离心 10min

3. 1.0mL 下层液,60氮气吹干;

4. 加入 100μL 乙腈溶解干燥物,并加入 900μL 样品稀释液,充分混匀;

5. 50μL 稀释后液体待测。

稀释倍数:8

七、酶联免疫检测步骤

测定前须知:

1 使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。

2 使用之后立即将所有试剂放回 2~8 ℃。

3 在使用中不要让微孔干燥

4 ELISA 分析中的重复性,很大程度上取决于洗板的一致性,正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的要点。

5 在所有恒温孵育过程中,避免光线照射,用盖板膜盖住微孔板。

测定步骤:

1 将所需试剂和微孔板从冷藏环境中取出,在室温下平衡30 min,每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做 2个平行试验。

 

2 加标准品:加标准品/样本 50  L 到对应的微孔中,再加入酶标记物 50  L/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置室温避光反应 15 min

3 洗板:小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加洗涤液 250μL/孔,每次浸泡 15~30 s,充分洗涤 4~5 次,用吸水纸拍干。

4 显色:加入底物液 A 50 μL/孔,再加底物液 B 50 μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置 25℃避光环境反应 15 min。

5 测定:每孔各加 50 μL 终止液,设定酶标仪 450 nm 处,测定 OD 值(建议用 450/630 nm 双波长检测,在 5 min内读完数据)。

八、结果分析

所测得的标准液或样品吸光度的平均值(B)除以第一个标准液(0 标准液)的吸光度(B 0 )值再乘以 100%,得到百分吸光度值。

百分吸光度值(%)=B/ B0 *% 100

以标准品浓度的 10 为底的对数为 X 轴, 百分吸光值为 Y 轴,绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线,从标准曲线上读出样本所对应的值,作为 10 的幂,乘以稀释倍数,即为样品中所含黄曲霉 B1 的量。利用试剂盒专业分析软件进行计算,更便于大量样品

的准确、快速分析。

九、试剂盒灵敏度、准确度、精密度

试剂盒灵敏度:0.1 ppb

样本最低检测限:

谷物………………………………………………0.8ppb

蛋糕…………………………………………………1ppb

花生、奶油蛋糕……………………………………1ppb

食用油………………………………………………1ppb

饲料、面粉、汤圆………………………………2.4ppb

啤酒………………………………………………0.5ppb

葡萄酒、酱油、醋………………………………0.8ppb

回收率:

谷物………………………………85±15%

蛋糕………………………………82±15%

花生、奶油蛋糕…………………82±15%

食用油……………………………85±15%

饲料、面粉、汤圆………………83±15%

啤酒………………………………84±15%

葡萄酒、酱油、醋………………84±15%

精密度:

试剂盒的变异系数均小于 10%

十、注意事项

1 室温低于 20 ℃或试剂及样本没有回到室温(20~25 ℃)会导致所有标准的 OD 值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会出现标准曲线不成线性,重复性不好的现象,所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、反应终止液为 2M 硫酸,避免接触皮肤;若不慎滴漏到皮肤上,请尽快用水冲洗。

4、不要使用过了有效日期的试剂盒;也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂,掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低;不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

5、保存试剂盒于 2~8 ℃,不要冷冻,将不用的微孔板放

进自封袋重新密封;标准物质和无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下。

6、显色试剂有任何颜色表明发色剂变质,应当弃之;0标准的吸光度(450 nm)值小于 0.5A 450nm < 0.5)时,表示试剂可能变质。

7、在加入底物液后,一般显色 15 min 即可。若颜色较浅,可延长反应时间到 20 min(或更长),但不得超过 30 min;反之,则减短反应时间。

8 该试剂盒最佳反应温度为 25 ,温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

十一、贮藏条件及保存期

贮藏条件:在 2~8 ℃保存试剂盒。

保存期:本试剂盒有效期为 12 个月。



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